Cultura celular básica – O ambiente de cultura
Uma das principais vantagens da cultura de células é a capacidade de manipular a pressão físico-química (isto é, temperatura, pH, pressão osmótica, O2 e CO2) e o ambiente fisiológico (isto é, concentrações hormonais e de nutrientes) em que as células se propagam. Com exceção da temperatura, o ambiente de cultura é controlado pelos meios de crescimento.
O ambiente fisiológico da cultura não é tão bem definido como o seu ambiente físico-químico, o que vinha ocorrendo pela necessidade da presença do soro fetal bovino para complementação das necessidades celulares. Hoje, uma melhor compreensão dos componentes do soro, a identificação dos fatores de crescimento necessários para a proliferação celular, e estudos profundos do microambiente das células em cultura (ie, interações célula-célula, difusão de gases, interações com a matriz) agora permitem a cultura de certas linhagens de células em meios livres de soro.
Cultura Aderente x Cultura em Suspensão
Existem dois sistemas básicos para crescimento de células em cultura, como monocamadas num substrato artificial (i.e., cultura aderente) ou flutuando livremente no meio de cultura (cultura em suspensão). A maioria das células derivadas de vertebrados, com exceção das linhas de células hematopoiéticas e poucas outras, são dependentes de ancoragem e têm que ser cultivadas em um substrato adequado que é especificamente tratado para permitir a adesão e disseminação celular (isto é, tratado para cultura de tecidos). No entanto, muitas linhas celulares podem também ser adaptadas para cultura em suspensão. Da mesma forma, a maioria das linhas celulares de insetos comercialmente disponíveis crescem bem em cultura de monocamada ou suspensão. As células que são cultivadas em suspensão podem ser mantidas em frascos de cultura que não são tratados para cultura de tecidos, mas quando a proporção volume de cultura para área de superfície é aumentada para além do qual a troca de gás adequada é impedida (geralmente 0,2 a 0,5 ml/cm2), o meio requer agitação. Esta agitação é normalmente conseguida com um agitador magnético ou um revolvedor de frascos roller.
Meio
O meio é o componente mais importante do ambiente de cultura por fornecer os nutrientes, fatores de crescimento e hormônios necessários para o crescimento das células, bem como a regulação do pH e da pressão osmótica da cultura.
Embora os experimentos iniciais de cultura celular tenham sido realizados em meios naturais obtidos a partir de extratos de tecidos e fluidos corporais, a necessidade de padronização e qualidade, assim como o aumento da demanda, levaram ao desenvolvimento de meios quimicamente definidos. As três classes básicas de meio são meio basal, meio reduzido em soro e meios isentos de soro, que mnemonicamente diferem na sua necessidade de suplementação com soro fetal bovino.
O soro possui compostos de vital importância, como fonte de fatores de crescimento e adesão, hormônios, lipídios e minerais, para a cultura de células em meio basal. Além disso, o soro também regula a permeabilidade da membrana celular e serve como um transportador para lipídios, enzimas, micronutrientes e elementos traços na célula.
No entanto, o uso de soro no meio tem várias desvantagens, incluindo alto custo, problemas com padronização, especificidade e variabilidade, e efeitos indesejáveis, tais como estimulação ou inibição do crescimento e/ou função celular em certas culturas. Se o soro não for obtido de uma fonte confiável, a contaminação também pode representar uma séria ameaça à cultura celular bem-sucedida. Todos os produtos Thermo FisherTM, incluindo SERA, são testados contaminação e garantido pela sua qualidade, segurança, consistência e conformidade.
Meio basal
A maioria das linhas celulares crescem bem em meios basais, que contêm aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos e uma fonte de carbono, como a glicose, mas essas formulações de meio básico devem ser complementadas com soro.
Meio reduzido em soro
Outra estratégia para reduzir os efeitos indesejados do soro em experimentos de cultura celular é usar meio de soro reduzido. Os meios séricos reduzidos são formulações de meios básicos enriquecidos com nutrientes e fatores derivados de animais, que reduzem a quantidade de soro necessária.
Meio sem soro
O meio sem soro (SFM) contorna problemas com o uso de soros de animais, substituindo o soro por formulações nutricionais e hormonais adequadas. Existem formulações de meios isentos de soro para muitas culturas primárias e linhas celulares, incluindo linhas produtoras de proteínas do ovário de hamster chinês (CHO), várias linhas celulares de hibridoma, as linhas de insectos Sf9 e Sf21 (Spodoptera frugiperda), e para linhas celulares que atuam como
hospedeiras para produção viral, como 293, VERO, MDCK, MDBK e outros. Uma das principais vantagens da utilização de meios sem soro é a capacidade de tornar o meio seletivo para tipos específicos de células, escolhendo a combinação apropriada de fatores de crescimento. A tabela ao lado as vantagens e desvantagens dos meios livres de soro.
A Life Technologies ™ oferece uma ampla gama de mídias basais clássicas, meios séricos reduzidos, e sem soro, bem como soros, fatores de crescimento, suplementos, antibióticos e reagentes para seus experimentos de cultura celular. Para obter mais informações sobre produtos de cultura celular, consulte www.thermofisher.com e www.datamedweb.com.br.
pH
A maioria das linhagens normais de células de mamíferos cresce bem a pH 7,4 e há muito pouca variabilidade entre diferentes linhagens celulares. No entanto, algumas linhas transformadas foram demonstradas crescer melhor em ambientes ligeiramente mais ácidos (pH 7,0-7,4), e algumas linhas celulares de fibroblastos normais preferem ambientes um pouco mais básicos (pH 7,4-7,7). Linhas celulares de insetos, tais como Sf9 e Sf21 crescem otimamente a pH 6,2.
CO2
O meio de crescimento controla o pH da cultura e tampona as células em cultura contra alterações no pH. Normalmente, esse efeito é obtido pela inclusão de um tampão orgânico (por exemplo, HEPES) ou com base no sistema bicarbonato-CO2. Pelo pH do meio ser dependente do delicado equilíbrio de dióxido de carbono dissolvido (CO2) e bicarbonato (HCO3–), mudanças no CO2 no ambiente podem alterar o pH do meio. Portanto, é necessário usar CO2 exógeno ao usar meios tamponados com tampões de base bicarbonato-CO2, especialmente se as células são cultivadas em placas abertas ou linhas celulares transformadas cultivadas em altas concentrações. Enquanto a maioria dos pesquisadores costuma usar 5-7% de CO2 no ambiente de cultura, 4-10% CO2 é comum para a maioria dos experimentos de cultura celular. No entanto, cada meio tem uma tensão de CO2 recomendada para que a concentração de bicarbonato atinja o pH correto e a osmolaridade; consulte as instruções do fabricante do meio para obter mais informações.
Temperatura
A temperatura ideal para cultura de células depende em grande parte da temperatura corporal do hospedeiro a partir do qual as células foram isoladas e, em menor grau, variação anatómica da temperatura (por exemplo, a temperatura da pele pode ser inferior a temperatura do músculo esquelético). O superaquecimento é um problema mais sério do que o sobreaquecimento para culturas celulares; Portanto, muitas vezes a temperatura na incubadora é definida ligeiramente inferior à temperatura ideal.
- A maioria das linhas celulares humanas e de mamíferos são mantidas a 36 °C a 37 °C para crescimento;
- Células de insetos são cultivadas a 27 °C para crescimento ideal; eles crescem mais lentamente a temperaturas menores e a temperaturas entre 27 e 30 °C. Acima de 30 °C, a viabilidade das células de insetos diminui, e não se recuperam mesmo depois de retornarem ao 27 °C;
- As linhas de células aviárias requerem 38,5 °C para crescimento máximo. Embora essas células também possam mantida a 37 °C, elas crescerão mais lentamente;
- Linhas celulares derivadas de animais de sangue frio (por exemplo, anfíbios, peixes de água fria) toleram uma ampla faixa de temperatura entre 15 °C e 26 °C.
Observe que as condições de cultura de células variam para cada tipo de célula. As consequências de se desviar das condições de cultura necessárias para um determinado tipo de célula pode variar da expressão de fenótipos aberrantes a uma falha completa da cultura de células. Por isso recomendamos que você se familiarize com sua linha de células e interesse siga as instruções fornecidas com cada produto que você está usando em seus experimentos.
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